I.
I.
Pembhasan
Hati merupakan organ yang mempunyai
peranan vital dalam proses metabolisme dan detoksifikasi. Kerusakan pada hati
dapat berakibat fatal bagi tubh, sehingga perlu dideteksi adanya kerusakan hati
dimana salah satu pengujiannya dapat dilakukan secara sederhana dengan
pemeriksaan kadar bilirubin. Hati merupakan organ yang mempunyai peranan vital
dalam proses metabolisme dan detoksifikasi. Kerusakan pada hati dapat berakibat
fatal bagi tubh, sehingga perlu dideteksi adanya kerusakan hati dimana salah
satu pengujiannya dapat dilakukan secara sederhana dengan pemeriksaan kadar
bilirubin.
Bilirubin sebagian besar berasal
dari heme pada hemoglobin yang dilepaskan pada saat terjadi kerusakan pada sel
darah merah yang sudah tua yaitu sekitar 120 hari. Langkah awal pemecahan gugus
heme ialah pemutusan jembatan alfa metena membentuk biliverdin suatu terpenoid
linier. Besi mengalami beberapa kali reaksi reduksi dan oksidasi, reaksi-reaksi
ini memerlukan oksigen dan NADPH. Pada akhir reaksi dibebaskan Fe3+ yang dapat
digunakan kembali, karbon monoksida yang berasal dari atom karbon jembatan
metena dan bilverdin. Biliverdin, suatu pigmen berwarna hijau akan direduksi
oleh biliverdin reduktase yang mengandung NADPH sehingga rantai metenil menjadi
metilen antara cincin pirol III-IV dan membentuk petunjuk reaksi degradasi ini
(Israr, 2010)
Bilirubin yang terbentuk dari
pengurain heme ini adalah bilirubin tak terkonjugasi yang tidak larut dalam
air. Bilirubin tak terkonjugasi ini diikat oleh albumin dan protein lain,
kemudian beredar melalui peredaran darah. Setibanya di dalam hepar, bilirubin
tak terkonjugasi dilepas oleh hepar dari albumin, kemudian digabung dengan
glukoronid sehingga dapat melarut dalam air dan disebut bilirubin terkonjugasi.
Melalui kanakuli, bilirubin terkonjugasi ikut dengan empedu dan masuk ke vesika
felea dan duodenum. Dalam, duodenum, bilirubin terkonjugasi diubah menjadi
uribilinogen. Sebagian uribilinogen ini dikerluarkan melalui feses dalam dalam
bentuk sterkonilin, yang memberi warna pada fese dan diabsorbsi. Setelah itu direabsorbsi,
setibanya di dalam hepar, hepar melepaskannya kedalam darah untuk diambil
kembali, yang lain dikeluarkan melalui urine ( baradero et, al , 2008)
Pada percobaan kali ini dilakukan
pemeriksaan fungsi hati dengan metode pemeriksaan kadar bilirubin. Bilirubin
dapat digunakan sebagi salah satu parameter pemeriksaan fungsi hati karena
bilirubin merupakan hasil pemecahan heme dari sel darah merah akan mengalami
konjugasi di hati dengan asam glukoronat dengan bantuan enzimuridyl diphospahte
glucoronyl transferasi (UDGPT) sehingga menjadi bilirubin-glukoronat yang lebih
larut air (bilirubin direk) akan disekresikan ke empedu untuk mengemulsikan
lemak diusus. Apabila ada gangguan fungsi hati, jumlah bilirubin indirek (hasil
pemecahan heme) akan banyak terdapat didarah, sedangkan jumlah bilirubin direk
sedikit terbentuk akibatnya bilirubin yang tidak larut air akan berikatan
dengan direk protein jaringan pada kulit, mata dan jaringan lain yang
menimbulkan warna kuning pada jaringan tersebut.
Pada praktikum ini dilakukan
pengukuran kadar bilirubin total serta bilirubin terkonjugasi dengan metode
evelyn-malley. Absorban yang diukur yaitu absorbansi larutan uji bilirubin
total dan larutan uji bilirubin terkonjunggasi.
Pada pengujian kadar bilirubin
total, pertama tama dilakukan pembuatan blanko sampel. Blanko sampel dibuat
dengan mencampurkan serum dengan asecelerator lalu ditambahkan diazo blank.
Pembuatan larutan blanko bertujuan untuk kalibrasi atau sebagai larutan
pembanding dalam analisis. Biasanya lartutan blanko tidak berisi larutan yang
dianalisis hanya berisi pelarut dan reagen yang dilakukan untuk mengkalibrasi
spektrofotometri, akan tetapi pada praktikum ini blanko yang digunakan
ditambahkan sampel dengan jumlah yang sama seperti larutan uji yaitu 50 mikro
liter dan menggunakan diazo blank, hal tersebut dilakukan agar pengujian yang
dilakukan lebih spesifik karena bilirubin merupakan zat dengan pigmen warna
kuning yang menyebabkan kemungkinan adanya gangguan senyawa lain yang mempunyai
intensitas warna yang sama kemudian jadi pengotor ketika pengujian dengan
spektrofotometri. Serum yang digunakan dalam percobaan ini adalah serum tidak
mengandung fibronogen tetapi masih terkandung selain bilirubin seperti karoten,
xantofil dan hemoglibin maka dilakukan dengan metode evelyn-malloy untuk pasien
dewasa , sedangkan apabila serum digunakan dalam pemeriksaan kadar bilirubin
pada bayi yang menggunakan spektorskopi yang sebelumnya diencerkan dengan
larutan fisiolgis sampai warna nya sebanding dengan larutan kalium dikromat
0,01% yang disebut icterus index, maka
serum yang didalam nya terkadung selain bilirubin seperti karoten, xantofil dan
hemoglibin juga dapat memberikan kontribusi yang menggagu hasil yang mungkin
tidak valid pada icterus index. Sedangkan asecelerator digunakan
untuk memutus ikatan , asecelerator yang digunakan dalam percobaan ini yaitu
methanol 50% dikarenakan menggunakan metode evelyn-malloy. Metanol 50% dalam
asecelerator yang digunakan tujuan nya untuk memutus ikatan antara bilirubin
dan albumin dan yang kedua dilakukan pembuatan larutan uji dengan menambahkan
serum , ascelerator namun perbedaan nya dalam larutan uji ditambahkan reagen
diazo diperoleh
dengan cara mereaksikan asam sulfanilat dengan natrium nitrit yang akan
membentuk diazobenzensulfonat yang dapat digambarkan pada reaksi :
Asam
sulfanilat + natrium Nitrit diazobenzensulfonatρ
Setelah terbentuk -diazobenzensulfonat, maka -diazobenzensulfonat akanbereaksi
dengan billirubin yang terdapat pada sampel sehingga terbentuk azobilirubin yang
berwarna biru yang kemudian intensitas warnanya dapat diukur dengan spektrofotometri.
adapun reaksinya dapat digambarkan pada reaksi dibawah ini:
Pada pengujian kadar bilirubin
direk , pertama – tama dilakukan pembuatan blanko sampel yang didalamnya
terdapat serum, aquadest, dan diazo
blank. Aquadest ditambahkan dalam larutan blanko pada pengujian bilirubin direk
bertujuan untuk menyamakan volume dengan larutan uji dan larutan blangko karena
pada saat pengujian perlakuan yang diberikan harus sama, aquadest dipilih untuk
digunakan karenakan bilirubin direk
bersifat larut dalam air sehingga dapat tercampur dengan baik, sedangkan yang
kedua dilakukan pembuatan larutan uji yang didalam nya terdapat serum ,
aquadest dan reagen diazo. larutan blanko sampel dan larutan standar baik
pemeriksaan bilirubin total maupun direk telah ditambahkan reagen diazo
terakhir karena setelah terbentuk p-diazobenzensulfonat, maka
diazobenzensulfonat akan bereaksi dengan
billirubin yang terdapat pada sampel sehingga terbentuk azobilirubin yang berwarna
biru sehingga intensitas
warnanya dapat diukur
dengan spektrofotometer. selanjutnya dilakukan fortex selama 1 menit
setelah itu disimpan dalam laci yang tidak bisa ditembus cahaya.
Suhu dan waktu inkubasi merupakan
salah satu faktor yang mempengaruhi kesetimbangan reaksi oleh karena itu
campuran harus difortex dan di tunggu 10 menit pada suhu kamar (20-25°C), difortex 1 menit berguna untuk
menghomogenitas campuran larutan sehingga reaksi
yang terjadi dapat berjalan merata hingga diperoleh kesetimbangan reaksinya dan
10 menit disimpan didalam laci hal tersebut dilakukan karena faktor luar yaitu
cahaya dapat menggangu reaksi enzimatis yang sedang berlangsung, sehingga
tercapainya kesetimbangan reaksi,
pemeriksaan harus dilakukan dengan teliti dari mulai memasukan bahan-bahan
sampai memperhatikan waktu yang tidak boleh melebihi waktu yang telah
ditetapkan hal tesebut dapat berpengaruh terhadap hasil yang akan diperoleh.
Apabila waktu pemeriksaan lebih dari yang ditentukan akan mengakibatkan hasil
nilai absorbansi tidak sama rata dikarenakan apabila lebih lama akan banyak
yang bereaksi dan nilai absorbansi akan lebih besar atau terjadinya pengurain
dan pencemaran dikarenakan waktu yang berlebih. Kemudian setelah 10 menit di
ukur absorbansinya, semakin tinggi absorbansi
maka semakin banyak
billirubin yang terkandung dalam
darah.
Pada pada perinsipnya pengujian
kadar billirubin total memerlukan waktu inkubasi yang lebih lama dibandingkan pada pengujian kadar
billirubin terkonjugasi. Hal tersebut terjadi karena pada pengujian kadar
bilirubin total diperlukan waktu untuk mengubah bilirubin yang terikat dengan
albumin menjadi bilirubin bebas sehingga waktu
inkubasinya lebih
lama dibandingkan dengan
pengujian kadar bilirubin terkonjugasi yang tidak ada reaksi
pemecahan bilirubin dengan bantuan accelerator. Akan tetapi pada percobaan ini waktu inkubasi bilirubin total dan bilirubin
direk sama yaitu 10 menit.
Setelah didiamkan selama 10 menit
dalam suhu ruangan pada pengujian kadar bilirubin total dan pengujian kadar
bilirubin terkonjuugasi, maka larutan uji dan
blanko sampel dimasukkan kedalam
spektrofotometri. Ketika larutan
uji dimasukkan dalam spektrofotometri, maka
terjadi penyerapan gelombang elektromagnetik pada daerah
visible (380-780 nm) yaitu pada panjang gelombang 546 nm oleh senyawa yang
memiliki gugus kromofor yang terdapat dalam larutan uji (Azobilirubin). Karena
cahaya yang ditembakkan mengandung energi (E= h. c/ )λ menyebabkan terjadinya
eksitasi elektron molekul
tersebut dari keadaan
dasar (ground state) ke tingkat energi yang lebih tinggi. Ketika
elektron-elektron tersebut tereksitasi, maka spektrofotometer menghasilkan
nilai absorbansi, dimana absorbansi ini setara dengan jumlah energi yang
dioabsorpsi oleh molekul untuk mengeksitasi elektron dari keadaan dasar ke tingkat
energi yang kebih tinggi.
Proses eksitasi
elektron dari ground state ke tingkat energi yang lebih tinggi terdapat
berbagai persyaratan yang harus dipenuhi dalam suatu pengujian baik secara kualitatif
ataupun kuantitatif. Syarat
tersebut terdiri dari
spesifisitas, sensitivitas, presisi dan akurasi. Akurasi adalah
kemampuan metode untuk mengukur dan
mendeteksi nilai aktual
atau nilai sebenarnya
dari dalam sampel,
akurasi
merupakan ukuran
ketepatan atau kedekatan
hasil pengujian dengan
hasil yang sebenarnya. Presisi adalah
tingkat kesesuaian antara
hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian
berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama.
Sensitifitas atau kepekaan adalah kemampuan metode untuk mendeteksi atau
mengukur sampel dalam jumlah sekecil mungkin. Spesifisitas adalah kemampuan
metode untuk meendeteksi atau mengukur sampel tertentu secara cermat dan
seksama dengan adanya bahan atau matriks lain. (Ibrahim, 2010).
Dalam praktikum ini
didapatkan nilai absorbansi untuk larutan uji bilirubin total 0,131 A sedangkan
larutan uji untuk bilirubin direk 0,058 A. Setelah dilakukan perhitungan hasil
dari bilirubin total yang dikalikan faktor kalibratornya yaitu 5,895 mg/dL
sedangkan perhitungan hasil dari bilirubin direk yang dikalikan faktor
kalobratornya yaitu 0,29 mg/dL. Dari hasil yang diperoleh pada pemeriksaan
bilirubin total melebihi nilai rujukan pada pasien dewasa yang normal yaitu
0,1±1,2 mg/dL. Peningkatan kadar bilirubin total menunjukkan bahwa kadar bilirubin indireknya
juga tinggi.
